ਖਬਰਾਂ

IPTG (isopropyl-β-D-thiogalactoside) β-galactosidase ਸਬਸਟਰੇਟ ਦਾ ਇੱਕ ਐਨਾਲਾਗ ਹੈ, ਜੋ ਕਿ ਬਹੁਤ ਜ਼ਿਆਦਾ ਪ੍ਰੇਰਿਤ ਹੈ।ਆਈਪੀਟੀਜੀ ਦੇ ਇੰਡਕਸ਼ਨ ਦੇ ਤਹਿਤ, ਪ੍ਰੇਰਕ ਰਿਪ੍ਰੇਸਰ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਦੇ ਨਾਲ ਇੱਕ ਕੰਪਲੈਕਸ ਬਣਾ ਸਕਦਾ ਹੈ, ਤਾਂ ਜੋ ਰੀਪ੍ਰੈਸਰ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਦੀ ਰਚਨਾ ਬਦਲੀ ਜਾਵੇ, ਤਾਂ ਜੋ ਇਸਨੂੰ ਟੀਚਾ ਜੀਨ ਨਾਲ ਜੋੜਿਆ ਨਾ ਜਾ ਸਕੇ, ਅਤੇ ਨਿਸ਼ਾਨਾ ਜੀਨ ਕੁਸ਼ਲਤਾ ਨਾਲ ਪ੍ਰਗਟ ਕੀਤਾ ਜਾ ਸਕੇ।ਇਸ ਲਈ ਪ੍ਰਯੋਗ ਦੇ ਦੌਰਾਨ IPTG ਦੀ ਇਕਾਗਰਤਾ ਕਿਵੇਂ ਨਿਰਧਾਰਤ ਕੀਤੀ ਜਾਣੀ ਚਾਹੀਦੀ ਹੈ?ਕੀ ਜਿੰਨਾ ਵੱਡਾ ਉੱਨਾ ਵਧੀਆ ਹੈ?
ਪਹਿਲਾਂ, ਆਓ IPTG ਇੰਡਕਸ਼ਨ ਦੇ ਸਿਧਾਂਤ ਨੂੰ ਸਮਝੀਏ: ਈ. ਕੋਲੀ ਦੇ ਲੈਕਟੋਜ਼ ਓਪਰੇਨ (ਤੱਤ) ਵਿੱਚ ਤਿੰਨ ਸੰਰਚਨਾਤਮਕ ਜੀਨ, Z,Y, ਅਤੇ A ਹੁੰਦੇ ਹਨ, ਜੋ ਕ੍ਰਮਵਾਰ β-galactosidase, permease ਅਤੇ acetyltransferase ਨੂੰ ਏਨਕੋਡ ਕਰਦੇ ਹਨ।lacZ ਲੈਕਟੋਜ਼ ਨੂੰ ਗਲੂਕੋਜ਼ ਅਤੇ ਗਲੈਕਟੋਜ਼, ਜਾਂ ਐਲੋ-ਲੈਕਟੋਜ਼ ਵਿੱਚ ਹਾਈਡਰੋਲਾਈਜ਼ ਕਰਦਾ ਹੈ;lacY ਵਾਤਾਵਰਣ ਵਿੱਚ ਲੈਕਟੋਜ਼ ਨੂੰ ਸੈੱਲ ਝਿੱਲੀ ਵਿੱਚੋਂ ਲੰਘਣ ਦੀ ਆਗਿਆ ਦਿੰਦਾ ਹੈ ਅਤੇ ਸੈੱਲ ਵਿੱਚ ਦਾਖਲ ਹੁੰਦਾ ਹੈ;lacA acetyl-CoA ਤੋਂ β-galactoside ਵਿੱਚ ਐਸੀਟਿਲ ਗਰੁੱਪ ਨੂੰ ਟ੍ਰਾਂਸਫਰ ਕਰਦਾ ਹੈ, ਜਿਸ ਵਿੱਚ ਜ਼ਹਿਰੀਲੇ ਪ੍ਰਭਾਵ ਨੂੰ ਹਟਾਉਣਾ ਸ਼ਾਮਲ ਹੁੰਦਾ ਹੈ।ਇਸ ਤੋਂ ਇਲਾਵਾ, ਇੱਕ ਓਪਰੇਟਿੰਗ ਕ੍ਰਮ O, ਇੱਕ ਸ਼ੁਰੂਆਤੀ ਕ੍ਰਮ P ਅਤੇ ਇੱਕ ਰੈਗੂਲੇਟਰੀ ਜੀਨ I ਹੈ। I ਜੀਨ ਕੋਡ ਇੱਕ ਰੀਪ੍ਰੈਸਰ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਹੈ ਜੋ ਓਪਰੇਟਰ ਕ੍ਰਮ ਦੀ ਸਥਿਤੀ O ਨਾਲ ਬੰਨ੍ਹ ਸਕਦਾ ਹੈ, ਤਾਂ ਜੋ ਓਪਰੇਨ (ਮੈਟਾ) ਨੂੰ ਦਬਾਇਆ ਜਾ ਸਕੇ ਅਤੇ ਬੰਦ ਕੀਤਾ ਹੋਇਆ.ਕੈਟਾਬੋਲਿਕ ਜੀਨ ਐਕਟੀਵੇਟਰ ਪ੍ਰੋਟੀਨ-ਸੀਏਪੀ ਬਾਈਡਿੰਗ ਸਾਈਟ ਦੀ ਸ਼ੁਰੂਆਤੀ ਕ੍ਰਮ P ਦੀ ਅੱਪਸਟਰੀਮ ਲਈ ਇੱਕ ਬਾਈਡਿੰਗ ਸਾਈਟ ਵੀ ਹੈ। ਪੀ ਕ੍ਰਮ, O ਕ੍ਰਮ ਅਤੇ CAP ਬਾਈਡਿੰਗ ਸਾਈਟ ਮਿਲ ਕੇ ਲੈਕ ਓਪਰੇਨ ਦੇ ਰੈਗੂਲੇਟਰੀ ਖੇਤਰ ਦਾ ਗਠਨ ਕਰਦੇ ਹਨ।ਜੀਨ ਉਤਪਾਦਾਂ ਦੇ ਤਾਲਮੇਲ ਵਾਲੇ ਪ੍ਰਗਟਾਵੇ ਨੂੰ ਪ੍ਰਾਪਤ ਕਰਨ ਲਈ ਤਿੰਨ ਐਨਜ਼ਾਈਮਾਂ ਦੇ ਕੋਡਿੰਗ ਜੀਨਾਂ ਨੂੰ ਉਸੇ ਰੈਗੂਲੇਟਰੀ ਖੇਤਰ ਦੁਆਰਾ ਨਿਯੰਤ੍ਰਿਤ ਕੀਤਾ ਜਾਂਦਾ ਹੈ।

ਲੈਕਟੋਜ਼ ਦੀ ਅਣਹੋਂਦ ਵਿੱਚ, ਲੈਕ ਓਪਰੇਨ (ਮੈਟਾ) ਦਮਨ ਦੀ ਸਥਿਤੀ ਵਿੱਚ ਹੁੰਦਾ ਹੈ।ਇਸ ਸਮੇਂ, PI ਪ੍ਰਮੋਟਰ ਕ੍ਰਮ ਦੇ ਨਿਯੰਤਰਣ ਅਧੀਨ I ਕ੍ਰਮ ਦੁਆਰਾ ਦਰਸਾਏ ਗਏ ਲੱਖ ਰੀਪ੍ਰੈਸਰ ਨੂੰ O ਕ੍ਰਮ ਨਾਲ ਜੋੜਿਆ ਜਾਂਦਾ ਹੈ, ਜੋ RNA ਪੌਲੀਮੇਰੇਜ਼ ਨੂੰ P ਕ੍ਰਮ ਨਾਲ ਬੰਨ੍ਹਣ ਤੋਂ ਰੋਕਦਾ ਹੈ ਅਤੇ ਟ੍ਰਾਂਸਕ੍ਰਿਪਸ਼ਨ ਦੀ ਸ਼ੁਰੂਆਤ ਨੂੰ ਰੋਕਦਾ ਹੈ;ਜਦੋਂ ਲੈਕਟੋਜ਼ ਮੌਜੂਦ ਹੁੰਦਾ ਹੈ, ਤਾਂ ਲੈਕ ਓਪਰੇਨ (ਮੈਟਾ) ਨੂੰ ਪ੍ਰੇਰਿਤ ਕੀਤਾ ਜਾ ਸਕਦਾ ਹੈ ਇਸ ਓਪਰੇਨ (ਮੈਟਾ) ਪ੍ਰਣਾਲੀ ਵਿੱਚ, ਅਸਲ ਪ੍ਰੇਰਕ ਆਪਣੇ ਆਪ ਵਿੱਚ ਲੈਕਟੋਜ਼ ਨਹੀਂ ਹੈ।ਲੈਕਟੋਜ਼ ਸੈੱਲ ਵਿੱਚ ਦਾਖਲ ਹੁੰਦਾ ਹੈ ਅਤੇ β-galactosidase ਦੁਆਰਾ ਉਤਪ੍ਰੇਰਕ ਹੁੰਦਾ ਹੈ ਤਾਂ ਜੋ ਐਲੋਲੇਕਟੋਜ਼ ਵਿੱਚ ਬਦਲਿਆ ਜਾ ਸਕੇ।ਬਾਅਦ ਵਾਲਾ, ਇੱਕ ਪ੍ਰੇਰਕ ਅਣੂ ਦੇ ਰੂਪ ਵਿੱਚ, ਰੀਪ੍ਰੈਸਰ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਨਾਲ ਜੁੜਦਾ ਹੈ ਅਤੇ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਦੀ ਬਣਤਰ ਨੂੰ ਬਦਲਦਾ ਹੈ, ਜੋ O ਕ੍ਰਮ ਅਤੇ ਟ੍ਰਾਂਸਕ੍ਰਿਪਸ਼ਨ ਤੋਂ ਰੀਪ੍ਰੈਸਰ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਨੂੰ ਵੱਖ ਕਰਨ ਵੱਲ ਲੈ ਜਾਂਦਾ ਹੈ।Isopropylthiogalactoside (IPTG) ਦਾ ਐਲੋਲੈਕਟੋਜ਼ ਵਰਗਾ ਹੀ ਪ੍ਰਭਾਵ ਹੈ।ਇਹ ਇੱਕ ਬਹੁਤ ਹੀ ਸ਼ਕਤੀਸ਼ਾਲੀ ਪ੍ਰੇਰਕ ਹੈ, ਜੋ ਕਿ ਬੈਕਟੀਰੀਆ ਦੁਆਰਾ metabolized ਨਹੀ ਹੈ ਅਤੇ ਬਹੁਤ ਹੀ ਸਥਿਰ ਹੈ, ਇਸ ਲਈ ਇਸ ਨੂੰ ਵਿਆਪਕ ਪ੍ਰਯੋਗਸ਼ਾਲਾ ਵਿੱਚ ਵਰਤਿਆ ਗਿਆ ਹੈ.

IPTG ਦੀ ਸਰਵੋਤਮ ਇਕਾਗਰਤਾ ਨੂੰ ਕਿਵੇਂ ਨਿਰਧਾਰਤ ਕਰਨਾ ਹੈ?ਇੱਕ ਉਦਾਹਰਣ ਵਜੋਂ ਈ. ਕੋਲੀ ਲਓ।
ਈ. ਕੋਲੀ BL21 ਜੈਨੇਟਿਕ ਤੌਰ 'ਤੇ ਇੰਜਨੀਅਰਡ ਸਟ੍ਰੇਨ ਜਿਸ ਵਿੱਚ ਸਕਾਰਾਤਮਕ ਰੀਕੌਂਬੀਨੈਂਟ pGEX (CGRP/msCT) ਹੁੰਦਾ ਹੈ, ਨੂੰ 50μg·mL-1 Amp ਵਾਲੇ LB ਤਰਲ ਮਾਧਿਅਮ ਵਿੱਚ ਟੀਕਾ ਲਗਾਇਆ ਗਿਆ ਸੀ, ਅਤੇ ਰਾਤੋ ਰਾਤ 37°C 'ਤੇ ਸੰਸ਼ੋਧਿਤ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ।ਉਪਰੋਕਤ ਕਲਚਰ ਨੂੰ ਐਕਸਪੈਂਸ਼ਨ ਕਲਚਰ ਲਈ 1:100 ਦੇ ਅਨੁਪਾਤ 'ਤੇ 50μg·mL-1 Amp ਵਾਲੇ 50mL ਤਾਜ਼ੇ LB ਤਰਲ ਮਾਧਿਅਮ ਦੀਆਂ 10 ਬੋਤਲਾਂ ਵਿੱਚ ਟੀਕਾ ਲਗਾਇਆ ਗਿਆ ਸੀ, ਅਤੇ ਜਦੋਂ OD600 ਦਾ ਮੁੱਲ 0.6~ 0.8 ਸੀ, ਤਾਂ IPTG ਨੂੰ ਅੰਤਮ ਗਾੜ੍ਹਾਪਣ ਵਿੱਚ ਜੋੜਿਆ ਗਿਆ ਸੀ।ਇਹ 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1.0mmol·L-1 ਹੈ।ਉਸੇ ਤਾਪਮਾਨ ਅਤੇ ਉਸੇ ਸਮੇਂ 'ਤੇ ਸ਼ਾਮਲ ਕਰਨ ਤੋਂ ਬਾਅਦ, ਇਸ ਤੋਂ ਬੈਕਟੀਰੀਆ ਦਾ 1 ਮਿ.ਲੀ. ਘੋਲ ਲਿਆ ਗਿਆ ਸੀ, ਅਤੇ ਬੈਕਟੀਰੀਆ ਦੇ ਸੈੱਲਾਂ ਨੂੰ ਸੈਂਟਰੀਫਿਊਗੇਸ਼ਨ ਦੁਆਰਾ ਇਕੱਠਾ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ ਅਤੇ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਸਮੀਕਰਨ 'ਤੇ ਵੱਖ-ਵੱਖ IPTG ਗਾੜ੍ਹਾਪਣ ਦੇ ਪ੍ਰਭਾਵ ਦਾ ਵਿਸ਼ਲੇਸ਼ਣ ਕਰਨ ਲਈ SDS-PAGE ਦੇ ਅਧੀਨ ਕੀਤਾ ਗਿਆ ਸੀ, ਅਤੇ ਫਿਰ ਸਭ ਤੋਂ ਵੱਡੇ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਸਮੀਕਰਨ ਦੇ ਨਾਲ IPTG ਗਾੜ੍ਹਾਪਣ ਦੀ ਚੋਣ ਕਰੋ।
ਪ੍ਰਯੋਗਾਂ ਤੋਂ ਬਾਅਦ, ਇਹ ਪਾਇਆ ਜਾਵੇਗਾ ਕਿ IPTG ਦੀ ਗਾੜ੍ਹਾਪਣ ਸੰਭਵ ਤੌਰ 'ਤੇ ਜ਼ਿਆਦਾ ਨਹੀਂ ਹੈ.ਇਹ ਇਸ ਲਈ ਹੈ ਕਿਉਂਕਿ IPTG ਬੈਕਟੀਰੀਆ ਲਈ ਇੱਕ ਖਾਸ ਜ਼ਹਿਰੀਲਾ ਹੁੰਦਾ ਹੈ।ਇਕਾਗਰਤਾ ਤੋਂ ਵੱਧ ਸੈੱਲ ਨੂੰ ਵੀ ਮਾਰ ਦੇਵੇਗਾ;ਅਤੇ ਆਮ ਤੌਰ 'ਤੇ, ਅਸੀਂ ਉਮੀਦ ਕਰਦੇ ਹਾਂ ਕਿ ਸੈੱਲ ਵਿੱਚ ਜਿੰਨਾ ਜ਼ਿਆਦਾ ਘੁਲਣਸ਼ੀਲ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਪ੍ਰਗਟ ਕੀਤਾ ਜਾਵੇਗਾ, ਓਨਾ ਹੀ ਵਧੀਆ ਹੈ, ਪਰ ਬਹੁਤ ਸਾਰੇ ਮਾਮਲਿਆਂ ਵਿੱਚ ਜਦੋਂ IPTG ਦੀ ਗਾੜ੍ਹਾਪਣ ਬਹੁਤ ਜ਼ਿਆਦਾ ਹੁੰਦੀ ਹੈ, ਤਾਂ ਇੱਕ ਵੱਡੀ ਮਾਤਰਾ ਵਿੱਚ ਸ਼ਾਮਲ ਕੀਤਾ ਜਾਵੇਗਾ।ਸਰੀਰ, ਪਰ ਘੁਲਣਸ਼ੀਲ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਦੀ ਮਾਤਰਾ ਘਟ ਗਈ.ਇਸ ਲਈ, ਸਭ ਤੋਂ ਢੁਕਵੀਂ IPTG ਇਕਾਗਰਤਾ ਅਕਸਰ ਉੱਨੀ ਜ਼ਿਆਦਾ ਨਹੀਂ ਹੁੰਦੀ, ਪਰ ਘੱਟ ਇਕਾਗਰਤਾ ਹੁੰਦੀ ਹੈ।
ਜੈਨੇਟਿਕ ਤੌਰ 'ਤੇ ਇੰਜੀਨੀਅਰਿੰਗ ਸਟ੍ਰੇਨਾਂ ਨੂੰ ਸ਼ਾਮਲ ਕਰਨ ਅਤੇ ਕਾਸ਼ਤ ਕਰਨ ਦਾ ਉਦੇਸ਼ ਟੀਚਾ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਦੀ ਪੈਦਾਵਾਰ ਨੂੰ ਵਧਾਉਣਾ ਅਤੇ ਲਾਗਤਾਂ ਨੂੰ ਘਟਾਉਣਾ ਹੈ।ਟੀਚੇ ਦੇ ਜੀਨ ਦੀ ਸਮੀਕਰਨ ਨਾ ਸਿਰਫ ਤਣਾਅ ਦੇ ਆਪਣੇ ਕਾਰਕਾਂ ਅਤੇ ਸਮੀਕਰਨ ਪਲਾਜ਼ਮੀਡ ਦੁਆਰਾ ਪ੍ਰਭਾਵਿਤ ਹੁੰਦੀ ਹੈ, ਸਗੋਂ ਹੋਰ ਬਾਹਰੀ ਸਥਿਤੀਆਂ ਦੁਆਰਾ ਵੀ ਪ੍ਰਭਾਵਿਤ ਹੁੰਦੀ ਹੈ, ਜਿਵੇਂ ਕਿ ਪ੍ਰੇਰਕ ਦੀ ਇਕਾਗਰਤਾ, ਇੰਡਕਸ਼ਨ ਤਾਪਮਾਨ ਅਤੇ ਇੰਡਕਸ਼ਨ ਸਮਾਂ।ਇਸ ਲਈ, ਆਮ ਤੌਰ 'ਤੇ, ਕਿਸੇ ਅਣਜਾਣ ਪ੍ਰੋਟੀਨ ਨੂੰ ਪ੍ਰਗਟ ਕਰਨ ਅਤੇ ਸ਼ੁੱਧ ਕਰਨ ਤੋਂ ਪਹਿਲਾਂ, ਉਚਿਤ ਸਥਿਤੀਆਂ ਦੀ ਚੋਣ ਕਰਨ ਅਤੇ ਵਧੀਆ ਪ੍ਰਯੋਗਾਤਮਕ ਨਤੀਜੇ ਪ੍ਰਾਪਤ ਕਰਨ ਲਈ ਇੰਡਕਸ਼ਨ ਸਮਾਂ, ਤਾਪਮਾਨ ਅਤੇ IPTG ਗਾੜ੍ਹਾਪਣ ਦਾ ਅਧਿਐਨ ਕਰਨਾ ਸਭ ਤੋਂ ਵਧੀਆ ਹੈ।